En el inmunoblot, los antígenos recubiertos sobre membranas se utilizan como fase sólida para detectar anticuerpos específicos en muestras de pacientes. El tratamiento de las pruebas es manual, semiautomático o totalmente automatizado. Si una muestra contiene anticuerpos específicos, éstos se unen a los antígenos unidos a la membrana. En la siguiente fase, se añade un anticuerpo marcado con fosfatasa alcalina (AP) (conjugado), que se une a los anticuerpos específicos. La fosfatasa alcalina genera una reacción de color con el cloruro de nitroazul de tetrazolio/5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (NBT/BCIP) añadido posteriormente. Si existen anticuerpos específicos en la muestra del paciente, aparece una línea oscura en la posición del antígeno correspondiente. La intensidad del color de la solución resultante es proporcional a la concentración de anticuerpos en la muestra.