Real-Time-PCR

Für RNA-basierte Nachweise wird zunächst die RNA mittels reverser Transkription in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Bei DNA-basierten Nachweisen ist dieser Schritt nicht erforderlich. Jeder EURORealTime-Testsatz enthält alle PCR-Reagenzien in gebrauchsfertiger Form, inklusive der reversen Transkriptase und/oder DNA-Polymerase und der validierten spezifischen Primer und Sonden. Auf diese Weise wird die Zahl der Pipettierschritte auf ein Minimum reduziert: Es müssen lediglich die vorgefertigten PCR-Reagenzien zusammenpipettiert und die DNA/RNA hinzufügt werden. Die relevanten charakteristischen Abschnitte der DNA/cDNA werden mithilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) millionenfach vervielfältigt. Hierbei legen zwei Starter-DNA-Moleküle (Primer) den Bereich fest, der kopiert werden soll. Wenn die Patientenprobe den passenden DNA-Abschnitt (Zielsequenz) enthält, können die Primer daran binden und es wird eine Kopie der Zielsequenz hergestellt. Diese Reaktion wird mehrmals wiederholt, sodass die DNA-Region zwischen den Primern exponentiell vervielfältigt wird. Während jedes PCR-Zyklus binden zudem spezifische fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden an die Zielsequenz, die nur ein Fluoreszenzsignal erzeugen, wenn eine Vervielfältigung der DNA erfolgt ist. Am Ende eines PCR-Zyklus wird die Fluoreszenzintensität gemessen, sodass die Vervielfältigung der DNA in Echtzeit verfolgt werden kann. Wenn die Zielsequenzen in der Patientenprobe fehlen, können die Primer und Sonden nicht binden: Die DNA wird nicht vervielfältigt und es gibt keinen Anstieg des Fluoreszenzsignals. Durch das Mitführen von entsprechenden Quantifizierungsstandards erlaubt diese Methode auch eine Quantifizierung der DNA-Menge in der Ursprungsprobe. Des Weiteren können durch Verwendung mehrerer Fluoreszenzfarbstoffe mit unterschiedlichen Anregungs- und Emissionswellenlängen verschiedene DNA-Sequenzen in einem Reaktionsansatz nachgewiesen werden.